摘要

研究通過優(yōu)化電穿孔轉(zhuǎn)染體系，實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因在CHO細(xì)胞中的高效表達(dá)。利用威尼德電穿孔儀結(jié)合某試劑開發(fā)的基因載體，顯著提升轉(zhuǎn)染效率至85%以上，并通過分子雜交技術(shù)驗(yàn)證了基因整合穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，優(yōu)化后的體系在保證細(xì)胞存活率（>90%）的同時(shí)，熒光信號(hào)強(qiáng)度較傳統(tǒng)方法提升2.3倍，為重組蛋白生產(chǎn)提供了高性價(jià)比解決方案。

引言

CHO細(xì)胞作為生物制藥領(lǐng)域的重要宿主，其基因編輯效率與蛋白表達(dá)穩(wěn)定性直接影響藥物開發(fā)周期與成本。EGFP因其自發(fā)熒光特性，被廣泛用于實(shí)時(shí)監(jiān)測外源基因表達(dá)動(dòng)態(tài)。然而，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)存在效率低、細(xì)胞損傷大、表達(dá)水平波動(dòng)等問題，亟需開發(fā)更高效的基因遞送與調(diào)控方案。

本研究聚焦電穿孔技術(shù)的參數(shù)優(yōu)化，結(jié)合威尼德電穿孔儀的高壓脈沖控制模塊，旨在建立低損傷、高重復(fù)性的EGFP基因修飾體系。通過系統(tǒng)評(píng)估載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染條件及篩選策略，實(shí)現(xiàn)了CHO細(xì)胞中外源基因的精準(zhǔn)調(diào)控，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了可擴(kuò)展的技術(shù)路徑。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與儀器

細(xì)胞與載體：CHO-K1細(xì)胞系（某試劑提供）；pEGFP-N1質(zhì)粒（含CMV啟動(dòng)子及新霉素抗性基因）。

儀器設(shè)備：威尼德NanoPulse X系列電穿孔儀（脈沖范圍0-3000 V，脈沖寬度10 μs-100 ms）、威尼德UVCrosslinker紫外交聯(lián)儀（波長254 nm，能量密度0-9999 mJ/cm2）、分子雜交儀（某品牌）。

試劑：某試劑無血清電轉(zhuǎn)緩沖液、G418篩選培養(yǎng)基（某試劑）、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（某試劑）。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 質(zhì)粒遞送與電穿孔參數(shù)優(yōu)化

將CHO細(xì)胞重懸于某試劑電轉(zhuǎn)緩沖液（密度1×10? cells/mL），與20 μg線性化pEGFP-N1質(zhì)?；旌虾筠D(zhuǎn)移至威尼德電穿孔杯。通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化脈沖參數(shù)：電壓（800-1500 V）、電容（25-50 μF）、脈沖次數(shù)（1-3次）。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基，37℃靜置復(fù)蘇12小時(shí)。

2.2 基因整合驗(yàn)證

提取細(xì)胞基因組DNA，利用威尼德紫外交聯(lián)儀進(jìn)行Southern blot預(yù)處理（固定能量1200 mJ/cm2）。探針采用digaoxin標(biāo)記的EGFP片段，通過威尼德分子雜交儀完成雜交（42℃, 16 h），化學(xué)發(fā)光法顯影。

2.3 表達(dá)動(dòng)態(tài)監(jiān)測與篩選

轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，流式細(xì)胞術(shù)定量EGFP陽性率，篩選閾值設(shè)為熒光強(qiáng)度≥103。采用梯度濃度G418（200-800 μg/mL）加壓篩選14天，每72小時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)及細(xì)胞增殖率。

2.4 穩(wěn)定性與功能驗(yàn)證

連續(xù)傳代10次后，通過qPCR檢測EGFP基因拷貝數(shù)，Western blot分析蛋白表達(dá)量。使用某試劑凋亡檢測試劑盒評(píng)估長期篩選對(duì)細(xì)胞活性的影響。

結(jié)果與討論

1. 電穿孔參數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響

威尼德電穿孔儀在1200 V、35 μF單脈沖條件下，細(xì)胞存活率達(dá)92.3%，EGFP陽性率85.7%，較傳統(tǒng)脂質(zhì)體法（陽性率≤60%）顯著提升。高電壓短脈沖模式有效減少細(xì)胞膜不可逆損傷，同時(shí)某試劑電轉(zhuǎn)緩沖液的離子優(yōu)化配方進(jìn)一步降低電解副反應(yīng)。

2. 基因整合穩(wěn)定性

Southern blot顯示EGFP基因以單拷貝形式整合于CHO基因組中，威尼德紫外交聯(lián)儀的均一能量輸出保障了DNA固定效率（雜交信號(hào)CV值<5%）。連續(xù)傳代后qPCR檢測顯示基因拷貝數(shù)變異系數(shù)為8.2%，表明整合位點(diǎn)穩(wěn)定性符合工業(yè)化生產(chǎn)要求。

3. 成本與靈敏度優(yōu)勢(shì)

某試劑無血清電轉(zhuǎn)體系使單次轉(zhuǎn)染成本降低40%，且無需后續(xù)血清置換。流式分選結(jié)合低劑量G418篩選（維持濃度400 μg/mL），將篩選周期從21天縮短至14天，單克隆株熒光強(qiáng)度達(dá)1.2×10?（較傳統(tǒng)方法提升2.3倍）。

結(jié)論

研究通過整合威尼德電穿孔儀的高精度脈沖控制與某試劑的低成本轉(zhuǎn)染體系，成功構(gòu)建了高效、穩(wěn)定的EGFP-CHO細(xì)胞株。該方案在轉(zhuǎn)染效率、基因表達(dá)一致性及操作成本方面均優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，適用于大規(guī)模重組蛋白生產(chǎn)。未來將進(jìn)一步驗(yàn)證其在單克隆抗體等復(fù)雜蛋白表達(dá)中的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

1. 腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染豚鼠鞏膜成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 鮑慶東 ,劉太祥 ,羅鑫 . 眼科新進(jìn)展 . 2020,第011期

2. 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究 [J] . 寧昌 ,胡鍇勛 ,余長林 . 中國美容醫(yī)學(xué) . 2011,第002期

3. 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染兔間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 王冬梅 ,石蓓 ,許官學(xué) . 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) . 2011,第002期

4. 重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因經(jīng)角膜基質(zhì)瓣轉(zhuǎn)染兔角膜基質(zhì)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 [J] . 湯明芳 ,陸曉和 ,馬驪 . 廣東醫(yī)學(xué) . 2008,第004期

5. 1型重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外研究 [J] . 湯明芳 ,陸曉和 ,高基民 . 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) . 2008,第005期