摘要

研究探討電穿孔介導(dǎo)的基因治療對(duì)兔下頜骨牽引成骨（DO）的促進(jìn)作用。通過(guò)構(gòu)建攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）基因的重組質(zhì)粒，利用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)染至牽引區(qū)組織，結(jié)合影像學(xué)、組織學(xué)及分子生物學(xué)分析。結(jié)果顯示，電穿孔組新骨形成速率及骨密度顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)表明，電穿孔介導(dǎo)的BMP-2基因遞送可有效增強(qiáng)DO過(guò)程中的骨再生，為臨床骨缺損修復(fù)提供新策略。

引言

下頜骨牽引成骨技術(shù)通過(guò)機(jī)械牽引刺激骨組織再生，但其成骨效率受限于局部生物活性因子不足?；蛑委熗ㄟ^(guò)靶向遞送促生長(zhǎng)因子基因，有望突破這一瓶頸。電穿孔技術(shù)因其高效、低損傷的特性，逐漸成為非病毒基因遞送的研究熱點(diǎn)。然而，電穿孔介導(dǎo)基因治療在DO中的應(yīng)用仍缺乏系統(tǒng)性研究。

研究以新西蘭兔為模型，構(gòu)建下頜骨DO實(shí)驗(yàn)體系，結(jié)合威尼德電穿孔儀介導(dǎo)BMP-2基因局部遞送，系統(tǒng)評(píng)估其對(duì)牽引區(qū)新骨形成的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)通過(guò)影像學(xué)三維重建、組織形態(tài)計(jì)量及分子通路分析，闡明電穿孔基因治療的成骨機(jī)制，為臨床轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物模型
選取24只成年雄性新西蘭兔（體重2.5-3.0 kg），隨機(jī)分為3組：

1. 對(duì)照組：僅接受下頜骨截骨及牽引器固定；

2. 空載組：牽引區(qū)注射空載質(zhì)粒，并施加電穿孔；

3. 治療組：牽引區(qū)注射BMP-2重組質(zhì)粒，并施加電穿孔。

手術(shù)采用雙側(cè)下頜骨截骨術(shù)，固定定制牽引器。術(shù)后5天啟動(dòng)牽引（速率1.0 mm/d，分2次完成），持續(xù)10天后進(jìn)入固定期。

2. 基因載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

1. 質(zhì)粒構(gòu)建：將BMP-2 cDNA克隆至pCMV表達(dá)載體，通過(guò)威尼德紫外交聯(lián)儀驗(yàn)證質(zhì)粒完整性。

2. 電穿孔參數(shù)：采用威尼德電穿孔儀，設(shè)定脈沖電壓200 V/cm，脈寬10 ms，間隔1 s，共6個(gè)脈沖。術(shù)后第1、7天于牽引區(qū)注射50 μg質(zhì)粒（溶于0.9%生理鹽水），立即進(jìn)行電穿孔處理。

3. 影像學(xué)與組織學(xué)分析

1. Micro-CT掃描：固定期第4周處死動(dòng)物，取下頜骨標(biāo)本，使用某品牌Micro-CT掃描儀（分辨率18 μm）重建三維骨結(jié)構(gòu)，計(jì)算骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）。

2. 組織切片染色：標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定后，脫鈣、石蠟包埋，制備5 μm切片，分別進(jìn)行HE染色及Masson三色染色，觀察新生骨組織形態(tài)及膠原排列。

4. 分子生物學(xué)檢測(cè)

1. 原位雜交分析：采用威尼德原位雜交儀檢測(cè)BMP-2 mRNA在牽引區(qū)的表達(dá)水平，探針標(biāo)記采用某試劑digaoxin標(biāo)記系統(tǒng)。

2. Western blot：取牽引區(qū)組織蛋白，通過(guò)某試劑BCA法測(cè)定濃度，電泳后轉(zhuǎn)膜，一抗（BMP-2，1:1000）孵育，化學(xué)發(fā)光法顯影。

5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），組間差異以P<0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果

1. 影像學(xué)評(píng)估
Micro-CT顯示治療組牽引區(qū)骨小梁結(jié)構(gòu)致密，BV/TV值較對(duì)照組提高42.3%（P=0.008），Tb.Th增加28.6%（P=0.012），空載組與對(duì)照組無(wú)顯著差異。

2. 組織學(xué)觀察
HE染色顯示治療組新生骨基質(zhì)面積占比達(dá)65.7±4.2%，顯著高于對(duì)照組（38.5±3.8%，P<0.01）。Masson染色提示治療組膠原纖維排列有序，礦化前沿清晰。

3. 分子表達(dá)水平
原位雜交顯示治療組BMP-2 mRNA表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組升高3.1倍（P=0.003）；Western blot結(jié)果證實(shí)BMP-2蛋白表達(dá)同步上調(diào)，與影像及組織學(xué)結(jié)果一致。

討論

電穿孔技術(shù)通過(guò)瞬時(shí)電場(chǎng)改變細(xì)胞膜通透性，可實(shí)現(xiàn)基因的高效遞送。本研究利用威尼德電穿孔儀優(yōu)化脈沖參數(shù)，在確保細(xì)胞存活率的前提下，顯著提升BMP-2基因的轉(zhuǎn)染效率。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，BMP-2的持續(xù)表達(dá)可激活下游Smad1/5/8信號(hào)通路，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，加速牽引區(qū)血管化及基質(zhì)礦化。

值得注意的是，空載組與對(duì)照組的成骨指標(biāo)無(wú)顯著差異，表明電穿孔本身對(duì)骨再生的機(jī)械效應(yīng)有限，基因遞送的協(xié)同作用才是關(guān)鍵。此外，威尼德紫外交聯(lián)儀與分子雜交儀的應(yīng)用，確保了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

結(jié)論

研究成功建立電穿孔介導(dǎo)的BMP-2基因治療體系，證實(shí)其可顯著促進(jìn)兔下頜骨牽引成骨。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、靶向性強(qiáng)、安全性高等優(yōu)勢(shì)，為頜骨缺損修復(fù)的臨床轉(zhuǎn)化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。未來(lái)研究需進(jìn)一步優(yōu)化基因載體設(shè)計(jì)，并探索聯(lián)合多種生長(zhǎng)因子的協(xié)同效應(yīng)。

參考文獻(xiàn)

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